CARA MENGATASI MASALAH BILA PRIMER / OLIGO BELUM BISA KELUAR BAND HASIL PCR

CARA MENGATASI MASALAH BILA PRIMER / OLIGO BELUM BISA KELUAR BAND HASIL PCR
Oleh : Agung Surono, S.Si.

Bila kita menggunakan primer / oligo lalu dari hasil PCR belum bisa keluar band / pita maka hal yang perlu kita lakukan adalah mencek hal-hal berikut :
1. Cek stok larutan primer / oligo forward dan reverse (stok biasanya dengan konsentrasi 100 M = 100 pmol). Ambil 10 µl larutan stock primer / oligo lalu dielektroforesis. Kalau muncul pita DNA primer berarti primer tidak ada masalah. Lalu dilanjutkan dengan pengujian berikutnya yaitu cek stok DNA. Tapi kalau tidak muncul pita DNA primer maka primer / oligo ada masalah dan kita tahu titik permasalahannya ada di bagian primer..
2. Cek sampel DNA yang dipakai. Diuji 5 µl atau 10 µl dari stok larutan DNA kemudian dielektroforesis. Cara pengujian sampel DNA yaitu :
Kalau kita menggunakan stok DNA dengan volume 5 µl :
Ambil 5 µl sampel DNA + 1 µl loading dye.
Kalau kita menggunakan stok DNA dengan volume 10 µl :
Ambil 10 µl sampel DNA + 2 µl loading dye.
Kalau muncul pita DNA berarti sampel DNA bagus tidak masalah. Lalu dilanjutkan dengan pengujian berikutnya yaitu cek modifikasi program PCR yaitu cek modifikasi suhu annelingnya. api kalau tidak muncul pita berarti DNA sampel ada masalah dan kita tahu permasalahannya ada di bagian stok DNAnya.

Harusnya hasil cek stock primer / oligo dan sampel DNA menunjukkan hasil seperti yang nampak di bawah ini :

Keterangan :
1. Ladder DNA yang 1 kb. Pita tertinggi 10.000 bp dan terendah 100 bp.
2. Primer forward (F).
3. Primer reverse ®.
4. Sampel DNA.
Bila saja pengujian primer / oligo, sampel DNA serta laddernya tidak muncul pita berarti yang bermasalah adalah pada agarosenya. Karena kalau agarosenya masih bagus laddernya harus muncul pita-pitanya karena ladder adalah standartnya jadi kalau agarose masih bagus harus muncul pitanya.
Variasi konsentrasi yang di loading di gel :
Primer forward (F) 100 µM muncul pita atau tidak.
Primer forward (F) 10 µM muncul pita atau tidak.
Primer reverse (R) 100 µM muncul pita atau tidak.
Primer reverse (R) 10 µM muncul pita atau tidak.
Sampel DNA pekat (spektrofotometer) muncul pita atau tidak.
Sampel DNA encer (spektrofotometer) muncul pita atau tidak.
3. Cek modifikasi program PCR terutama suhu annelingnya / penempelan primer pada DNA template. Suhu anneling bisa dimodifikasi naik 1-2°C dari acuan yang ada atau sebaliknya turun 1-2 °C dari acuan yang ada.
4. Bila saja setelah dimodifikasi di suhu annelingnya masih juga tidak muncul pita DNA hasil PCR, padahal hasil cek primer / oligo ataupun cek stok DNAnya tidak ada masalah maka kita perlu langkah berikutnya yaitu cek master mixnya akan tetapi kalau melakukan cek master mix kita perlu adanya pembanding dari master mix. Artinya kita harus mencek menggunakan master mix yang sebelumnya kita pakai dengan master mix dari produsen master mix yang lainnya. Dan pengujian master mix ini dilakukan secara bersamaan.