Berbagai Cara Sterilisasi Eksplan Tumbuhan Dalam Kultur Jaringan Tumbuhan

Berbagai Cara Sterilisasi Eksplan Tumbuhan Dalam Kultur Jaringan Tumbuhan

Eksplan Meristem Apikal Tebu

- Ambil meristem apical tebu 20 - 30 cm, helaian daun dipotong dekat sarung daun.

- Material dimasukkan ke dalam spiritus/alkohol 96% lalu dibakar. Kemudian 1 - 2 helai seludang daun dibuang.

- Bagian ujung material tebu di bakar lagi, diikuti penglepasan seludang terluar. Perlakuan ini diulang sampai beberapa kali.

- Setelah batang beserta seludangnya yang putih terlihat, bahan siap untuk dijadikan eksplan.

- Eksplan dipotong-potong melintang setebal 2 - 4 mm, kemudian ditanam pada media kultur.

Sumber : Hendaryono dan Wijayani, 1994.
Namun prosedur ini tidak mampu menekan tingkat kontaminasi.
Tunas muda batang tebu dengan diameter 0,8-1 cm dipotong-potong sepanjang 5-10 cm,lalu direndam dalam air sabun selama 15 menit dan dibilas dengan air mengalir sampai bersih.kemudian disterilisasi dengan cara sebagai berikut:
a. Dicelup dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkoholnya habis.
b. Direndam dalam larutan agrimisin 0,2% selama 1,5 jam, lalu direndam dalam larutan Dithane M-45 0,2% selama 1,5 jam, yang masing-masing telah ditambah 2 tetes Tween 80. Lalu dibilas akuades steril sebanyak 3-4 kali.
c. Sama dengan b, tetapi setelah itu dicelup ke dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkoholnya habis.
d. Direndam dalam larutan agrimisin 0,5% selama 1,5 jam, lalu dalam larutan Dithane M-45 0,5% selama 1,5 jam, yang masing-masing telah ditambah 2 tetes Tween 80, lalu dibilas dengan akuades steril sebanyak 3-4 kali.
e. Direndam dalam larutan agrimisin 0,5% selama satu jam, lalu dalam larutan Dithane M-45 0,5% selama satu jam, yang masing-masing telah ditambahi 2 tetes Tween 80, lalu dibilas  dengan akuades steril sebanyak 3-4 kali. Setelah itu dicelup ke dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkohol habis.
Sterilisasi dilakukan dalam kotak transfer yang telah disterilisasi dengan sinar UV selama 2 jam. Eksplan yang ujungnya mengalami klorosis akibat pengaruh larutan pensteril dipotong dan dibuang karena diperkirakan jaringan eksplan tersebut telah mati. Eksplan yang masih segar dipotong-potong sepanjang 0,5-1 cm dengan pisau diseksi steril.
Penanaman Eksplan. Eksplan ditanam dalam medium dengan posisi tegak dan diletakkan dalam ruang kultur pada temperatur 25-27 oC, dengan intensitas penyinaran 800-1000 lux selama 16 jam per hari. 

Eksplan Meristem Akar Wortel

Bahan yang digunakan ialah umbi akamya, tetapi lebih baik lagi jika menggunakan jaringan kambium dan sekitarnya.

Langkah kerja:

- Umbi wortel dicuci dengan deterjen, kemudian disterilisasi fisik denganpembakaran.

- Sterilisasi dengan 0,1% sublimat, (pencucian).

- Kulit  luar  dikupas dalam laminar air flow (secara steril).

- Material dipotong setebal 2 cm, dimasukkan ke dalam sublimat  +/- 3 menit,kemudian dicuci dengan air steril 3 - 4 kali.

- Dipotong-potong 2 mm x 2 mm x 2 mm untuk ditanam pada media kultur.

Sumber : Hendaryono dan Wijayani, 1994

Mekanisme sterilisasi eksplan secara kimiawi

Tunas Apikal Krisan (Chrysanthemum morifolium Ram.)
Proses sterilisasi yang dilakukan di  luar  laminar  air  flow adalah    eksplan    direndam    dengan 5,25%  NaOCl  20%  selama  7  menit, dibilas  air  steril  selama  5  menit,  lalu 5,25   %   NaOCl      10%   selama   10 menit,  kemudian  eksplan  direndam aquadest  selama  5  menit, kemudian sterilisasi  dilakukan didalam laminar   air   flow yaitu eksplan direndam dalam larutan Betadine 0,25%   direndam   selama   5   menit. Setelah itu eksplan   dibilas      dalam   aquadest selama  5  menit.  

Tunas Pohon Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg)
Bahan  tanam  yang  digunakan  sebagai  eksplan adalah batang karet muda pada tahap pertumbuhan dua  payung   daun   yang   berasal   dari   biji   yang   telah terseleksi   dan dipelihara   di   rumah   kaca.   Sehari  sebelum  diambil,  batang  karet  diolesi  dengan  dithane 0,5%  yang  berfungsi  sebagai  fungisida.  Pengambilan  eksplan   dilakukan   dengan   memotong   batang   muda  sekitar  10 – 15  cm  dari  pertautan  okulasi,  kemudian  dibawa ke laboratorium untuk proses sterilisasi.
Batang   karet   yang   akan   digunakan   sebagai eksplan   dicuci   dengan   air   mengalir   hingga   bersih, kemudian dicuci dengan larutan Desogerme 0,5% (v/v) yang merupakan larutan bakterisida dan   fungisida dengan   bahan   aktif quaternary   alkyl   chloride dan garam polyiminobiguanidide.    Selanjutnya    eksplan direndam   selama lebih   kurang satu menit dalam larutan  etanol  70%  (v/v),  lalu  direndam  dalam  larutan H2O2 (hidrogen  peroksida) 17,6%  (v/v)  selama  20 menit.   Setelah   itu   eksplan   dibilas   menggunakan aquades   steril   hingga   seluruh   eksplan   bersih   dari larutan sterilan.

Tunas Acacia mangium

Dengan perlakuan sterilisasi bahan NaOCl dengan konsentrasi 0,5 % dan HgCl2 dengan konsentrasi 0,15 mg/l dengan lama perendaman eksplan selama 10 menit.

Metode sterilisasi eksplan nodia durian berurutan :

detergen (10 menit),

clorox 20% (5 menit),

clorox 10% (5 menit),

alkohol 70% (2 menit),

setiap berganti larutan dibilas dengan aquades steril.

Untuk metode sterilisasi eksplan daun durian berurutan :

detergen (10 menit),

clorox10%  (3 menit),

clorox 5% (3 menit)

dan alkohol 70% (2 menit)

dan dibilas dengan akuades steril seperti pada nodia.

Setelah tahap sterilisasi, eksplan nodia dan daun ditanam  pada media MS + ZPT yang sudah disiapkan.

Eksptan Mata Tunas Anggrek

Mata tunas dari :

a. tangkai Bunga Phalaenopsis,

b. keiki atau tunas yang muncul dari batang anggrek yang sudah tua,

c. batang anggrek Cattleya.

Tangkai bunga Phalaenopsis

Langkah kerja:

Tangkai bunga anggrek.tangkai bunga dipotong 3 cm dari mata tunas ke atas dan ke bawah.

Disterilkan dalam chlorox 10% +1 tetes tween 20 selama 10 menit.

Seludang yang menutupi mata tunas dibuang.

Disterilkan dalam Chlorox 5% + I tetes tween 20 selama 5 menit.

Dicuci dengan air steril 3 - 5 kali.

Tangkai bagian atas dan bawah dipotong sedikit, kemudian ditanam dalam media kultur.

Sumber : Hendaryono dan Wijayani, 1994.

Keiki Dendrobium
Tunas baru atau keiki yang panjangnya 10 cm atau kurang dapat daijadikan sebagai bahan tanam atau biasa disebut dengan istilah eksplan. Tunas atau keiki dipotong dengan menggunakan pisau tajam. Setelah keiki dipotonmg kemudian dicuci dengan menggunakan deterjen sambil digosok-gosok untuk menghilangkan debu-debu dan kotoran yang menempel di permukaan tunas. Penggunaan deterjen dan perlakuan penggosokan ini berfungsi agar permukaan tunas atau keiki lebih peka terhadap perlakuan bahan-bahan  sterilan .
Setelah itu biarkan tunas berada di bawah siraman air selama 10 menit agar debu-debu dan kotoran yang menempel di permukaan tunas larut dan selain itu juga siraman air ini bisa memecahkan koloni bakteri ataupun jamur yang ada di permukaan tunas atau keiki.

Daun-daun yang melekat pada tunas semuanya dipotong dengan menggunakan pisau atau gunting dan setelah dilakukan pemotongan pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam transfer box yang bisa berupa enkast ataupun laminar air flow.

Setelah berada di transfer bos tunas / keiki yang telah dihilangkan daunnya tersebut kemudian dicelupkan ke dalam larutan alkohol 70 % selama beberapa menit dan selanjutnya dimasukkan ke dalam gelas piala steril yang berisi larutan clorox 20 % (satu bagian clorox dilarutkan ke dalam 4 bagian aquadest steril) dan seluruh bagian eksplan harus terendam di dalam larutan sterilisasi selama 5 – 7 menit. Setelah itu dibilas menggunakan larutan aquadest steril.

Apabila sebelum 5 – 7 menit jaringan tunas / keiki telah memucat atau menjadi putih itu berarti jaringannya telah mengalami bleach out dan perendaman harus segera dihentikan.

Setelah dibilas menggunakan aquadest steril langkah selanjutnya eksplan tunas / keiki dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi clorox 10 % dan direndam selama 5 menit.

Setelah direndam dalam larutan clorox 10 % lalu eksplan dikeluarkan dan dilanjutkan dengan pembilasan dengan aquadest steril sambil digojog sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit.

Setiap pengambilan eksplan tunas/keiki di salam larutan pencuci dengan menggunakan pinset steril dan setiap kali menggunakan pinset, pinsetnya dicelupkan di dalam larutan alkohol dan dibakar dengan menggunakan lampu sepritus atau lampu bunsen.

Setelah dibilas sebanyak 3 kali eksplan tunas / keiki selanjutnya diletakkan ke dalam cawan petri berdiameter 12 cm yang ada alas kertas saring steril. Eksplan selanjutnya diiris-iris diantara 2 buku dengan menggunakan skalpel steril. Mata tunas aksiler terdapat pada buku dengan posisi berselang seling. Kadang-kadang mata tunas ini sangat kecil dan berwarna pucat sehingga sukar dilihat. Setiap tunas / keiki yang panjangnya 10 cm dapat daibagi menjadi 4 – 5 bagian. Bagian pucuknya disebut dengan istilah pucuk apikal.

Setiap bagian potongan ini kemudian diambil dengan menggunakan pinset steril dan dimasukkan secara hati-hati ke dalam media. Ingat jangan menyentuh eksplan, mulut botol, dan bagian dalam cawan petri dengan menggunakan tangan. Ambil semua keperluan dengan menggunakan pinset steril.

Setelah ditutup bagian luar botol di dekat mulut botol disemprot dengan menggunakan alkohol 70 %.

Jangan lupa menempelkan label yang berisi nama jenis anggrek yang kita tanam, jenis media dan banyaknya hormon yang kita tambahkan ke media serta tanggal penanaman.

Kultur yang berhasil menunjukkan tanda-tanda keberhasilan setelah 8 – 10 minggu. Eksplan nampak hijau dan mata tunas nampak membesar. Arah pertumbuhan eksplan dapat langsung membentuk tunas-tunas kecil atau membentuk bulatan-bulatan yang disebut plb (protocorm like bodie). Tunas plb ini kemudian memperbanyak diri dan memenuhi permukaan media.

Setiap 3 bulan sekali dilakukan subkultur dengan cara memindahkan tunas-tunas abaru yang terbentuk ke dalam botol yang berisi media yang baru yang lebih segar. Tujuan dari subkultur ini selain agar tunas baru yang terbentuk mendapatkan asupan media yang baru yang lebih segar juga untuk proses penjarangan agar pertumbuhan tunas barunya menjadi lebih optimal.

Ada juga dengan menggunakan cara lainnya untuk keiki Dendrobium ini.
Mata tunas keiki mula-mula disterilisasi secara kimiawi dengan menggunakan larutan Clorox 10 % dan satu tetes Tween 20 (tepol) selama 10 menit. Kemudian disterilkan lagi dengan menggunakan larutan Clorox 5 % dan ditambah satu tetes Tween 20 selama 5 menit. Setelah disterilisasi kemudian dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak 3 kali masing- masing selama 2 – 3 menit. Semua seludangnya kemudian dibuang lalu disayat pada setiap ruas keiki dengan satu mata tunas.

Eksplan dengan satu mata tunas kemudian ditanam pada media padat. Dalam waktu 7 – 10 hari akan tumbuh plantlet pada mata tunas yang terdapat pada eksplan tersebut.

Eksaplan dengan mata tunas dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml yang berisi 25 ml larutan media  cair VW . Selanjutnya erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan selanjutnya digojog dengan menggunakan shaker pada kecepatan 120 rpm.

Perkembangan tunas dari keiki ini akan menghasilkan bibit yang sifatnya sama persis dengan induknya. Ruas keiki yang berupa jaringan epidermis dapat juga menjadi plb. Sehingga dari satu mata tunas yang terdapat pada keiki dalam waktu satu bulan dapat tumbuh menjadi sebanyak 50 buah plb, dan dalam kurun waktu sub kultur selama satu tahun dapat menghasilkan 10 juta buah plb dari setiap mata tunas.  Agar plb dapat berkembang menjadi plantlet, maka harus dipindahkan ke dalam media padat.

Untuk keiki yang bagian ujung (yang masih sangat muda, berwarna hijau muda) dapat juga dikulturkan pada media padat. Namun karena tidak memiliki mata tunas, maka jaringan akan tumbuh membentuk kalus. Selanjutnya kalus akan tumbuh menjadi plantlet. Apabila kalus dipindahkan ke dalam media cair maka kalus akan tumbuh menjadi plb. Dan plb ini akan tumbuh menjadi plantlet apabila dipindahkan ke dalam media padat. 

Eksplan Daun Tembakau Seedling

Seedling berasal dari biji tembakau yang telah diseleksi.

Biji yangtenggelam dalam air dipilih dan ditanam.

Brji yang telah tumbuh diambildaunnya untuk bahan eksplan.

Langkah kerja:

- Diarnbil daun tembakau yang rnasih muda, dicuci dengan deterjen hinggabersih.

- Disterilkan dengan l0% Chlorox + I tetes tween 20 selama 5 menit.

Sterilisasi dengan sublimat.

- Dicuci dengan air steril 3 - 5 kali. Sterilisasi dilakukan dalam kondisi aseptis.

- Daun dipotong dengan ukuran 3 mm x 3 mm kemudian ditanam pada media kultur.

Untuk eksplan yang berasal dari daun yang diambil langsung dari lapang (alam), sterilisasi sebaiknya dilakukan dua kali.

- Dengan Chlorox 10% + 1 tetes tween 20 selama l0 menit.

- Dengan Chlorox 10% + 1 tetes tween 20 selama 5 menit.

- Dicuci dengan air steril 3 - 5 kali.

Sumber : Hendaryono dan Wijayani, 1994

Daun Pule Pandak [Rauvolfia serpentina (L.) Bentham ex Kurz.]

Etanol 60 % (0,5 menit)

Aquadest (3 menit)

Clorox 30 % (5 menit)

Aquadest 3 kali masing-masing selama 3 menit.

Ibu tulang daun, paling banyak mengandung berkas pengangkut baik untuk eksplan.

Bagran urat daun hanya berupa sel mesofil yang bertotipoteasi lebih kecil, tidak baik untuk eksplan.